蜂產(chǎn)品中蛋白質(zhì)測(cè)定方法的改進(jìn)

蜂產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的測(cè)定主要采用凱氏定氮法,其測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠,被廣泛采用。但其操作較繁雜,消化時(shí)間長(zhǎng),需蒸餾滴定,費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本法通過改進(jìn)消化條件,即采用過氧化氫2濃硫酸混合液為消化液,消化過程中滴加硝酸2高氯酸混合酸,縮短了消化時(shí)間。樣品中的蛋白質(zhì)與硫酸和催化劑一同加熱分解,生成的氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨,硫酸銨在堿性溶液中與次氯酸鹽生成一氯胺,在亞硝基鐵氰化鈉催化作用下與水楊酸生成藍(lán)色化合物,可在655 nm 波長(zhǎng)下比色定量。

1 　試驗(yàn)部分

1. 1 　儀器與試劑

定氮儀；可見分光光度計(jì)。顯色劑:稱取水楊酸5. 0 g ,加入水20 mL ,加入2 mol ·L - 1 氫氧化鈉溶液16 mL ,凱氏定氮儀；攪拌使之完全溶解,再取5. 0 g 酒石酸鉀鈉溶于少量水中,將上述溶液合并移入100 mL 容量瓶中,用水稀釋。次氯酸鈉溶液:取經(jīng)標(biāo)定的次氯酸鈉溶液用氫氧化鈉溶液稀釋成含有效氯的質(zhì)量濃度為3. 5 g ·L - 1 ,游離堿濃度為0. 75 mol ·L - 1 (以氫氧化鈉計(jì)) 。亞硝基鐵氰化鈉溶液:稱取亞硝基鐵氰化鈉(硝普鈉) 1. 0 g ,溶于少量純水中,并稀釋至100 mL ,質(zhì)量濃度10 g ·L - 1 。氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液: 臨用時(shí)稀釋成質(zhì)量濃度為1. 0 mg ·L - 1氨氮的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。試劑均為分析純,水為無(wú)氨去離子水。

1. 2 　試驗(yàn)方法

1. 2. 1 　樣品處理

稱取樣品2. 0 g 于250 mL 定氮瓶中,加入硫酸銅0. 5 g ,硫酸鉀5. 0 g ,硫酸2過氧化氫(2 + 1) 混合液20 mL ;搖勻后于瓶口放一小漏斗,置于有石棉網(wǎng)的可調(diào)電爐上,小火加熱,至泡沫停止后,加大火力,緩慢分次滴加硝酸2高氯酸(4 + 1) 混合酸2～3 mL ,樣液變藍(lán)透明后,繼續(xù)加熱30 min ,取下放冷后,加水20 mL ,冷卻后分次洗入500 mL (蜂蜜消化液洗入250 mL) 容量瓶中。移取樣品消化液5. 0 mL 于另一個(gè)100 mL 容量瓶中,加水至刻度備用,同時(shí)作試劑空白。

1. 2. 2 　樣品分析

移取樣品溶液與試劑空白液2. 0～5. 0 mL ,1. 0 mg ·L - 1 氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0 , 0. 50 , 1. 00 ,2. 00 ,4. 00 ,6. 00 ,8. 00 mL 分別于10 mL 具塞比色管中,往樣品管、試劑空白管及標(biāo)準(zhǔn)管中加顯色劑1. 0 mL ,10 g ·L - 1 亞硝基鐵氰化鈉溶液0. 2 mL ,3. 5 g ·L - 1 次氯酸鈉溶液0. 2 mL ,用水稀至刻度,混勻,靜置60 min 后,于655 nm 波長(zhǎng)處,用1. 0 cm比色皿,測(cè)定其吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品溶液中蛋白質(zhì)的含量。

2 　結(jié)果與討論

2. 1 　工作曲線

按試驗(yàn)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定,氮的質(zhì)量濃度在0～0. 8 mg ·L - 1 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,對(duì)試劑空白測(cè)定20 次,其3 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限,其檢出限為0. 014 mg ·kg - 1 。

2. 2 　精密度試驗(yàn)

取蜂王漿、花粉、蜂蜜樣品,按試驗(yàn)方法進(jìn)行6次測(cè)定,樣品測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 結(jié)果見表1 。

2. 3 　水楊酸法與凱氏定氮蒸餾法測(cè)定結(jié)果比較

隨機(jī)抽取了8 份峰產(chǎn)品樣品,分別用水楊酸法和凱氏定氮蒸餾法對(duì)樣品中蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn), t = 0 . 153 ,查t值表, t0. 05 (7) = 2 . 356 ,

 

所以P > 0. 05 ,兩方法測(cè)定蜂產(chǎn)品中蛋白質(zhì)無(wú)顯著性差異。結(jié)果見表2 。

2. 4 　回收率試驗(yàn)

取蜂王漿、花粉、蜂密樣品,加入氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理與測(cè)定,回收率測(cè)定結(jié)果見表3 。

通過改進(jìn)蜂產(chǎn)品蛋白質(zhì)消化的條件,有效地縮短了反應(yīng)時(shí)間,由原來的3. 5 h 縮至2 h 左右。由于水楊酸光度法樣品消化液不需要蒸餾,直接用于測(cè)定,更適宜于批量樣品的測(cè)定,水楊酸光度法與國(guó)標(biāo)法比較無(wú)顯著性差異,所以水楊酸光度法因其操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、迅速,可用于蜂產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的測(cè)定。