影響凱氏定氮法測定粗蛋白準(zhǔn)確性應(yīng)注意的問題

隨著飼料行業(yè)的飛速發(fā)展，飼料原料及其飼料產(chǎn)品的價(jià)格也居高不下。而粗蛋白的檢測是評(píng)定飼料原料及其產(chǎn)品的重要指標(biāo)之一，目前常用的為凱氏定氮法，即國家頒布的《飼料中粗蛋白的測定方法》(GB1996-6432)。但是該方法也存在著測定過程較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)等缺陷，測定時(shí)除嚴(yán)格按照規(guī)定程序操作外，還需要一定的實(shí)驗(yàn)技巧和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。因此有很多飼料企業(yè)在實(shí)際操作過程中總是出現(xiàn)各種問題，導(dǎo)致檢測結(jié)果異常而不知如何去分析。本文以GB/T6432-1994 為準(zhǔn)，針對(duì)影響凱氏定氮對(duì)測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)性應(yīng)注意的細(xì)節(jié)問題和大家共同

探討。當(dāng)然也有相對(duì)簡單的測定粗蛋白含量的方法，因?yàn)榭紤]到用國標(biāo)法測定粗蛋白的復(fù)雜性，而有時(shí)候我們沒必要對(duì)粗蛋白的含量做很精確的測定時(shí)，我們可以考慮用粗蛋白測定儀或者ZDDN-II凱氏定氮儀來測定物質(zhì)中粗蛋白的含量。雖然這種儀器相較于國標(biāo)法測定準(zhǔn)備度方面有所欠缺，但是簡單方便，而且更重要的原因是它測出的數(shù)據(jù)能夠達(dá)到我們需要的目的。

1粗蛋白的測定：試劑的配制

粗蛋白測定中所用的化學(xué)藥品如濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀( 硫酸鈉)、硫酸銨、蔗糖等均為化學(xué)純試劑，標(biāo)定鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用的無水碳酸鈉為基準(zhǔn)試劑。在配制試劑前一定要用p H 試紙或酸度計(jì)檢測一下蒸餾水是否為中性，所用的燒杯、試劑瓶等配液設(shè)備清洗干凈。

1.1 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液盡量為低濃度，一般C(HCl)=0.02 ～ 0.05mol • L-1。低濃度雖然用量大，但可減少操作誤差和讀數(shù)誤差。配制鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液一定要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行，基準(zhǔn)無水碳酸鈉已定于270 ～ 300℃灼燒至恒重，稱準(zhǔn)至0.0001g，做4 ～ 6 個(gè)平行樣，去掉最高值和最低值后取平均值，同時(shí)還要做空白試驗(yàn)。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制量盡量不要太多、使用時(shí)間太長，防止水分蒸發(fā)和鹽酸揮發(fā)而影響其濃度的準(zhǔn)確性。

1.2 其他試劑的配制

400g • L-1 氫氧化鈉溶液、20g • L-1 硼酸溶液、混合指示劑(1g •L -1 甲基紅乙醇溶液與5g • L -1 溴甲酚綠乙醇溶液等體積混合) 等主要是在稱量時(shí)要做到快、準(zhǔn)、穩(wěn)，再就是防止使用時(shí)間太長，特別是混合指示劑不要超過3 個(gè)月。

2粗蛋白的測定：試樣的選取和制備

2.1 采樣

飼料原料及產(chǎn)品的容積和質(zhì)量往往很大，因此所采集的樣品必須具有代表性，否則，即使一系列的分析工作非常精密、準(zhǔn)確，其意義都不大，有時(shí)甚至?xí)�得出錯(cuò)誤的結(jié)論，所以應(yīng)采用正確的采樣方法。采樣應(yīng)從具不同代表性的區(qū)域取幾個(gè)樣點(diǎn)，然后充分混合為整個(gè)飼料的代表樣品，然后再從中分出一小部分作為分析樣品。在采樣過程中應(yīng)做到隨即、客觀，避免受人為和主觀因素的影響。還有一點(diǎn)應(yīng)該注意，就是所采集的樣品必須具有一定數(shù)量。其采集數(shù)量的多少應(yīng)視飼料原料和產(chǎn)品水分含量、顆粒大小、均勻程度以及平行樣的數(shù)量而酌情定奪。

2.2 分樣

所采集的樣品往往較多，而檢測時(shí)所用試樣往往較少，因此要對(duì)所采集的樣品進(jìn)行縮分。在多數(shù)飼料公司以及檢測機(jī)構(gòu)中一般采用方便簡單的四分法。有條件的單位可采用分樣器進(jìn)行分樣。

2.3 粉樣

飼料的樣品一般為顆粒狀，所以要對(duì)所分得的試樣進(jìn)行粉碎。粉碎所用的設(shè)備一般為咖啡磨或植物樣本粉碎機(jī)，試樣粉碎后一般過40 目篩，且一定要把粉碎后的試樣及粉碎機(jī)中殘留的部分清掃后充分混合均勻，避免粉碎的試樣分級(jí)而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)于一些不易粉碎的粗飼料如秸稈渣等在粉碎機(jī)中會(huì)剩留極少難以通過篩孔，這部分一定不要丟掉，應(yīng)盡力弄碎后一并均勻混入樣品中，避免引起分析誤差。

2.4 稱樣

試樣的用量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定為0.5 ～ 1g，為保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，在分析過程中應(yīng)根據(jù)試樣蛋白質(zhì)含量的高低來決定所稱試樣的重量，如濃縮料、魚粉、玉米蛋白粉、豆粕等高蛋白的試樣可控制在0.5 ～ 1g之間，玉米、秸稈、苜蓿等低蛋白、粗飼料試樣可適當(dāng)增加到2 ～ 3g左右，以增加測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。還應(yīng)注意一點(diǎn)，在稱量時(shí)盡量用電子分析天平，準(zhǔn)確到0.0001g 且無損地放入凱氏燒瓶或者消化管中。

3 粗蛋白的測定：消化

3.1 催化劑及其用量

在環(huán)境污染小、價(jià)格便宜、催化效果好的前提下，目前催化劑多為硫酸銅和無水硫酸鉀( 或無水硫酸鈉)。其添加量不同公司差異較大，其中硫酸銅: 無水硫酸鉀( 或無水硫酸鈉) 主要有1∶9、1∶10、1∶15 和1∶17 等，國標(biāo)為0.4g 硫酸銅和6g 無水硫酸鉀( 或無水硫酸鈉)，比例為1∶12。若添加量加大，消化液易結(jié)塊不易轉(zhuǎn)移；添加量減少，消化時(shí)間加長或者消化不完全。建議大家按國標(biāo)執(zhí)行為好。亦可根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)以及試樣的多少、消化的難易程度、蛋白含量的多少自行調(diào)整。

3.2 硫酸的用量

濃硫酸的用量應(yīng)視試樣的重量、含水量及其所含蛋白高低而適當(dāng)調(diào)整。對(duì)于體積大重量輕的粗飼料、高蛋白飼料或者含水量較高的試樣、淀粉含量多的精料, 應(yīng)適當(dāng)加大濃硫酸的用量，多為15mL 左右。這是由于此類樣品，濃硫酸在對(duì)其脫水和碳化是消耗量加大，當(dāng)加入的濃硫酸量不足或者剛剛夠試樣脫水和碳化時(shí)就會(huì)出現(xiàn)燒干現(xiàn)象。反之則需加入10mL 左右。若通風(fēng)柜的排風(fēng)量較大時(shí)應(yīng)適當(dāng)多加濃硫酸2mL 左右，以防止?jié)饬蛩岬恼舭l(fā)而使其濃度降低，試樣消化不完全從而導(dǎo)致所測得的數(shù)值偏低。

3.3 消化溫度

剛開始時(shí)以低溫(200 ～ 300℃ ) 加熱，待試樣焦化泡沫消失后，逐步緩慢提高溫度(360～410℃ )。起初低溫加熱是為防止試樣起泡沫，而溢出燒瓶外或碳化后的顆粒粘附于燒瓶壁，導(dǎo)致消化不完全，所測結(jié)果偏低。對(duì)于富含脂肪或者在消化過程中易發(fā)泡的樣品，可在消化

前滴加少量消泡劑，如辛醇、液體石蠟等。

3.4 消化時(shí)間

消化時(shí)間也是許多文獻(xiàn)一直在探討的問題，也有許多快速消化法的研究。其消化時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)為消化呈透明藍(lán)綠色后，再加熱消化15min。根據(jù)蘇軍等研究表明，消化液澄清后再繼續(xù)消化30min 為宜。此試驗(yàn)只是針對(duì)于蛋白含量低于蠶蛹的樣品，而對(duì)于蛋白含量高于蠶蛹的樣品，如進(jìn)口魚粉、血粉、羽毛粉等并未進(jìn)行試驗(yàn)性研究。因此我個(gè)人認(rèn)為，可根據(jù)試樣的重量、蛋白含量的多少以及消化的難易程度而適當(dāng)調(diào)整消化液澄清后的消化時(shí)間。對(duì)于所稱試樣質(zhì)量較多、蛋白含量高于蠶蛹或者難消化的試樣，消化液澄清后繼續(xù)消化的時(shí)間可控制在45m i n ～ 2h 不等，具體時(shí)間化驗(yàn)工作者可根據(jù)自己的工作經(jīng)驗(yàn)而自行定奪。

3.5 消化液的轉(zhuǎn)移及定容

消化結(jié)束后，把凱氏燒瓶從電爐上取下，放在小鐵筐內(nèi)冷卻。此時(shí)一定要注意安全，帶稍厚手套防止?fàn)C傷。冷卻至室溫后加入蒸餾水10 ～ 20m L，在等冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到100m L 容量瓶內(nèi)。再轉(zhuǎn)移是為減少損失誤差，應(yīng)在容量瓶口上加上漏斗，且要用少量蒸餾水多次洗滌燒瓶和漏斗( 即采用少量多次原則)，否則會(huì)因偶然誤差而導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。轉(zhuǎn)移完成后不要立即定容，應(yīng)冷卻至室溫后再定容。若未冷卻而定容，待冷卻后，體積縮小，從而使吸取的試樣分解液的量偏大，測定結(jié)果將偏高。若消化完畢冷卻后，消化液不能當(dāng)天定容需隔夜保存時(shí)，應(yīng)先將凱氏燒瓶內(nèi)加入少量的蒸餾水，防止消化液結(jié)晶，再把凱氏燒瓶口用塑料布包好，防止吸收空氣中的氨而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。消化液若結(jié)晶不易轉(zhuǎn)移時(shí)，可將凱氏燒瓶放在電爐上加熱一下，待結(jié)晶融化后再轉(zhuǎn)移。

4粗蛋白的測定：蒸餾

4.1 蒸汽發(fā)生器內(nèi)水的體積及酸堿性

蒸汽發(fā)生器內(nèi)的水的體積應(yīng)控制在其容積的2/3 左右，并控制液面高度。水的體積過大易在沸騰后從蒸汽發(fā)生器中玻璃管中溢出燙傷工作人員；過少易產(chǎn)生的氣體壓力不足或蒸干蒸汽發(fā)生器發(fā)生事故。水加入的同時(shí)一同加入幾滴硫酸和幾滴混合指示劑，且保持水一直呈紫紅色，以防止水中含有氨態(tài)的氮溢出而影響測定值。

4.2 蒸餾裝置的氣密性

在蒸餾操作開始前一定要檢查一下蒸餾裝置的氣密性。各導(dǎo)管的接口及用久的橡皮管應(yīng)重點(diǎn)檢查。添加消化液和堿液的玻杯口要擰緊、液封，防止產(chǎn)生的氨氣逸出。在檢查氣密性的同時(shí)還應(yīng)打開冷凝水開關(guān)且要保持一定的流速，否則冷卻不完全。這是很容易忽視的問題，特別是初學(xué)者。

4.3 試樣分解液的移取要準(zhǔn)確

在移取試樣分解液前先把容量瓶搖勻,把10m L 移液管用所要取的試樣分解液潤洗2 ～ 3 次后，再進(jìn)行移取。移取時(shí)移液管應(yīng)垂直于地面，視線與移液管刻度線平行。吸取完試樣液后把移液管放到反應(yīng)室內(nèi)自然流入反應(yīng)室，切忌把移液管放到小玻杯內(nèi)及用吸耳球吹移液管。最后再用少量蒸餾水沖洗一下小玻杯，并把棒狀玻塞塞緊。

4.4 氫氧化鈉溶液的加入量

在蒸餾過程中，反應(yīng)室內(nèi)溶液應(yīng)保持堿性，堿的加入量一般為10m L 左右，若在消化時(shí)所加入的硫酸偏多，40% 氫氧化鈉溶液的量也要隨之增加，這樣才能保證除用于和硫酸及硫酸銅反應(yīng)外，還有足以使氨根轉(zhuǎn)化為氨的堿量。加入的堿先放入小玻杯內(nèi)，慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)棒狀玻塞，使堿緩慢流到反應(yīng)室內(nèi)，然后再將小玻杯內(nèi)加入蒸餾水液封，切忌把棒狀玻塞提起加堿—特別是初學(xué)者，這樣會(huì)造成反應(yīng)后生成的氨從�？谝莩觯瑢�(dǎo)致所測蛋白含量偏低。

4.5 蒸餾速度與氣流

蒸餾時(shí)產(chǎn)生的氣流一定要均勻，切忌熱力不穩(wěn)、中途中斷或蒸汽不足，否則反應(yīng)室內(nèi)溫度會(huì)降低，易產(chǎn)生倒吸；氣流過快硼酸吸收不完全。蒸餾的速度除與氣流有關(guān)外還與冷卻水的流速及電路的溫度有關(guān)。蒸餾速度快，反應(yīng)液易被蒸汽帶出而使測定結(jié)果偏高；蒸餾速度慢，氨沒有被完全蒸餾出來而結(jié)果偏低。那么以什么樣的蒸餾速度為宜呢？據(jù)賈艷玲和冷柏忠(2000) 實(shí)踐證明： 蒸餾速度一般應(yīng)控制在每分鐘蒸餾出液體在5 ～ 7mL 之間。

4.6 蒸餾時(shí)間

蒸餾時(shí)間多為5m i n，加入試樣分解液及氫氧化鈉后蒸餾4m i n , 使冷凝管末端離開硼酸液面后再蒸餾1m i n。但是標(biāo)準(zhǔn)中并未規(guī)定從何時(shí)開始計(jì)時(shí)，據(jù)謝文飛(2003) 的試驗(yàn)證明，在蒸餾完4m i n 鐘后再多蒸餾1 ～ 2mi n 對(duì)結(jié)果沒有什么影響，所以可以從硼酸剛剛出現(xiàn)綠色時(shí)開始計(jì)時(shí)蒸餾4min( 硼酸出現(xiàn)綠色說明反映已經(jīng)開始)。最終在4min 后是否蒸餾完全可用pH 試紙進(jìn)行檢測。在蒸餾時(shí)還應(yīng)注意硼酸的吸收溫度。硼酸是極弱的酸，只起吸收氨的作用，但要注意硼酸吸收液溫度不應(yīng)超過40℃，否則氨的吸收減弱導(dǎo)致結(jié)果偏低。

4.7 反應(yīng)室的冷卻與洗滌

首先在蒸餾完畢，將冷凝管末端用蒸餾水沖洗后，再將錐形瓶移開進(jìn)行滴定。清洗反應(yīng)室時(shí)嚴(yán)禁將蒸餾瓶兩側(cè)的閥門同時(shí)關(guān)閉，以免發(fā)生爆炸。反應(yīng)室清洗一定要徹底，一是防止殘留液影響下次測定結(jié)果的正確性；二是給反應(yīng)室降溫。如果反應(yīng)室溫度很高，再加之加入的氫氧化鈉與硫酸反應(yīng)放出的大量熱，易產(chǎn)生爆沸，將反應(yīng)液沖入冷凝管，造成實(shí)驗(yàn)失敗。另外反應(yīng)室溫度高，反應(yīng)劇烈，有部分氨硼酸吸收不完全而逸出，測得的結(jié)果將偏低。一般反應(yīng)室溫度降至不燙手即可。

4.8 錐形瓶的預(yù)處理

錐形瓶往往用洗衣粉洗滌，再用自來水、蒸餾水沖洗。洗衣粉不易徹底沖洗干凈，導(dǎo)致錐形瓶內(nèi)壁環(huán)境偏于堿性；另外各地自來水的p H 不同，所制的蒸餾水p H 有時(shí)也會(huì)偏離中性，這樣都會(huì)導(dǎo)致測定結(jié)果出現(xiàn)偏差。建議把錐形瓶進(jìn)行預(yù)處理后再使用，其方法為：沖洗干凈的錐形瓶加入20mL 蒸餾水、2 滴混合指示劑，再用0.02mol •L -1 的鹽酸溶液或者0.02m o l • L -1 的氫氧化鈉溶液滴定至剛好由藍(lán)色變?yōu)榛壹t色，然后倒掉該液體后，再加硼酸吸收液25 ～ 35m L 和混合指示劑2 ～ 3 滴。若加入指示劑后硼酸為藍(lán)色，則說明硼酸中混入堿性物質(zhì)或蒸餾水偏堿性，需重新配制硼酸溶液。錐形瓶的預(yù)處理雖然比較繁瑣，但是可減少由于錐形瓶本身環(huán)境的p H 偏離中性對(duì)測定結(jié)果的影響。

4.9 滴定

滴定是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的最后一步，至關(guān)重要，否則整個(gè)實(shí)驗(yàn)將前功盡棄。滴定前把鹽酸標(biāo)液瓶搖勻后，把酸式滴定管潤洗2 ～ 3 次后加入鹽酸標(biāo)液排除氣泡，記下刻度值，開始滴定。滴定時(shí)一定要控制好滴定速度，待接收液由淺綠色逐漸變成無色時(shí)要放慢滴定速度，逐滴加入鹽酸標(biāo)液，接收液變成淺紅色時(shí)為滴定終點(diǎn)，切勿滴過量。

5粗蛋白的測定：空白測定

5.1 試劑空白測定

另取凱氏燒瓶或者消化管一個(gè)，加入硫酸銅、無水硫酸鉀( 或無水硫酸鈉)、濃硫酸，其中每個(gè)藥品的加入量與試樣消化時(shí)的加入量相同，加熱消化至溶液呈透明的藍(lán)綠色。其后的操作步驟完全相同。這樣可以校正試劑不純所發(fā)生的誤差。

5.2 試樣空白測定

稱取0.5g 分析純蔗糖代替試樣，以后各種試劑的用量及操作步驟完全相同。其標(biāo)準(zhǔn)為，空白測定消耗0.1m o l • L -1 鹽酸標(biāo)液體積不超過0.2mL；消耗0.02mol •L-1 鹽酸標(biāo)液體積不超過0.3mL。以上兩個(gè)空白測定并不需要每次都要做，隔一段時(shí)間操作一次即可，但是在更換藥品試劑、標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)一定要做空白實(shí)驗(yàn)測定。若空白值超標(biāo)，一般是由于所用試劑級(jí)別不夠或不純、蒸餾水不純、玻璃器皿清洗不干凈等原因造成。

6粗蛋白的測定：蒸餾裝置及操作準(zhǔn)確性檢測

在進(jìn)行樣品檢測的同時(shí)，精確稱取0.2000g 分析純的硫酸銨代替試樣，直接定容100m L 后進(jìn)行蒸餾、滴定，測得硫酸銨含氮量為21.19% ±0.2%，以校正蒸餾裝置的氣密性和加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。

7粗蛋白的測定：計(jì)算時(shí)換算系數(shù)的處理

我們在計(jì)算蛋白含量時(shí)多乘以平均系數(shù)6.25，對(duì)于粗蛋白質(zhì)中含氮量尚未確定的可以乘以平均系數(shù)，對(duì)于已經(jīng)確定的則不妥，以豆粕為例：如果測定豆粕和以豆粕為主要原料的濃縮飼料的粗蛋白質(zhì)含量時(shí)，用6.25 作為蛋白質(zhì)的換算系數(shù)的話，比大豆的實(shí)際換算系數(shù)5.70 擴(kuò)大了0.54倍，相對(duì)誤差將在8% 左右，因此對(duì)于已經(jīng)確定的換算系數(shù)就用實(shí)際系數(shù)來換算，例如蕎麥、玉米用系數(shù)6.00，大豆、豌豆、蠶豆、燕麥、小麥、黑麥、箭舌草等用系數(shù)5.70，黃豆用系數(shù)5.71，大麥用系數(shù)5.83，棉籽、芝麻、葵花籽用系數(shù)5.30，花生用系數(shù)5.46，全脂大豆粉用系數(shù)5.72，牛奶用系數(shù)6.38。以上是用凱氏定氮法測定飼料中蛋白質(zhì)含量的一些體會(huì)、經(jīng)驗(yàn)，與大家共同探討。