SSR分子標記技術(shù)及其在構(gòu)建玉米DNA指紋庫上的應用2

2玉米DNA指紋庫的構(gòu)建

2． 1利用SSR分子標記構(gòu)建玉米DNA指紋庫

目前，國內(nèi)外對玉米種質(zhì)鑒定采用的遺傳標記仍以形態(tài)標記為主，參考同工酶和種子貯藏蛋白標記。但形態(tài)標記的表現(xiàn)受環(huán)境影響較大，鑒定工作量大，周期長，受季節(jié)限制。同工酶和種子貯藏蛋白標記多態(tài)性不夠豐富，同工酶還存在組織和器官特異性，取材有嚴格的一致性要求，所以鑒定結(jié)果不夠穩(wěn)定。近年來發(fā)展較快的分子標記是以DNA分子多態(tài)性為基礎(chǔ)的一種遺傳標記，能穩(wěn)定遺傳，可反映生物的個體和群體特征。由于它直接反映DNA水平上的差異，具有高度的專一性和特異性，不同物種、同一物種不同品種所得DNA指紋各異，就像人類的指紋一樣，成為當今最先進的指紋鑒定技術(shù)。一種理想的分子標記應具有以下特點：多態(tài)性高；重復性和穩(wěn)定性好；帶型清晰，容易統(tǒng)計；在染色體上均勻分布；中性；共顯性；簡單快速，易自動化；開發(fā)和使用成本低廉。DNA指紋技術(shù)的發(fā)展日新月異，除以Southern雜交為基礎(chǔ)的RFLP外，近幾年已發(fā)展出了多種以PCR為基礎(chǔ)的新的DNA指紋技術(shù)，如RAPD、AFLP、SSR、SCAR和ISSR等及以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的SNP技術(shù)。但是，不同分子標記的應用價值不同(袁力行等，2000；Saliba-(Mombani et a1.,2000)。RFLP技術(shù)多態(tài)性較低，遺傳信息有限，需要的DNA模板量大，而且操作復雜。RAPD技術(shù)盡管具有簡單易行、需DNA量少、自動化程度高和實驗周期短的優(yōu)點，但對反應條件較敏感，重復性差。AFLP具有多態(tài)性高和穩(wěn)定性好的優(yōu)點，但所需DNA模板量大，操作步驟復雜，同時它還是專利技術(shù)。與其他標記相比，以微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)的SSR標記在DNA指紋庫構(gòu)建上顯示了獨特的優(yōu)越性。SSR標記數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態(tài)性高；具有復等位基因的特性，提供的信息量大；以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；每個位點由設計的引物序列決定，便于不同實驗室相互交流合作開發(fā)引物，獲得的資料能夠在不同的實驗室重復并共享(李新海等，2000)。雖然SSR引物的開發(fā)費用相當高，但由于其巨大的應用潛力，在一些主要農(nóng)作物中SSR引物的開發(fā)正在進行中。目前，在玉米上已公開的SSR引物序列已達1800多對，并且每隔一段時間就有新的引物增加，為該技術(shù)在玉米DNA指紋圖譜中的應用提供了良好的條件。

2．2玉米DNA指紋庫構(gòu)建的意義及其作用

我國國家種質(zhì)庫目前已搜集整理玉米種質(zhì)15967份，在生產(chǎn)上每年種植面積在5萬畝以上的玉米雜交種約300個，已申請植物新品種保護的玉米雜交種和自交系1000多個，每年參加國家區(qū)試及各省市預試的品種數(shù)以千計，通過國家和各省市審定的品種數(shù)百個(孫世賢等，2005)。同時，由于少數(shù)骨干親本的集中應用，玉米品種間的遺傳差異越來越小，加之隨著轉(zhuǎn)基因等新技術(shù)在玉米育種中的應用，在原品種基礎(chǔ)上僅改良少數(shù)甚至單個性狀的依賴性派生品種將增多。上述諸方面因素使得完全根據(jù)形態(tài)性狀進行玉米品種的辨別越來越困難，給品種資源的收集、整理、鑒定篩選及品種的選育、保護及玉米開發(fā)中的種子生產(chǎn)、經(jīng)營、管理、維權(quán)等諸環(huán)節(jié)帶來不同程度的困難。鑒于上述種種問題，急需從DNA分子水平給予每個玉米雜交種和自交系以一個能夠準確表明其身份的身份證號碼。與傳統(tǒng)的形態(tài)學方法和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)相比，DNA標記技術(shù)能揭示更多的多態(tài)性，而且具有準確可靠、簡單快速、易于自動化的優(yōu)點，這是品種鑒定實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的前提，也是品種鑒定技術(shù)的發(fā)展趨勢。

2．2．1玉米的品種鑒定及保護

在同一物種中的各個品種存在大量的多態(tài)性標記，某一品種具有區(qū)別于其他品種的獨特標記即一些特異性DNA片段的組合就稱為該品種的“指紋”，各品種的獨特的指紋片段構(gòu)成該物種的DNA指紋庫，它具有類似于人的指紋那樣的高度個體特異性和穩(wěn)定性。DNA指紋庫在作物育種中有著廣泛應用：第一，每個品種DNA指紋差異可直接提供與目標性狀有關(guān)的DNA水平的信息，避免了環(huán)境的干擾，從而能大大提高雜交種育種中對親本及后代理想單株的選擇效率；第二，通過檢測品種是否具有該品種特有的標記指紋片段，可以有效地鑒定品種純度與真?zhèn)我约坝糜谛缕贩N登記和品種知識產(chǎn)權(quán)保護等。在已有的DNA指紋技術(shù)和應用基礎(chǔ)上進行我國玉米品種標準DNA指紋庫構(gòu)建的研究，這對保護玉米育成品種的知識產(chǎn)權(quán)和育種家的權(quán)益、提高種子市場的種子質(zhì)量具有重要意義。

2．2．2純度及真?zhèn)螜z測

在玉米雜交種生產(chǎn)與銷售過程中，建立以質(zhì)量檢測為中心的良種繁育與種子管理體系，對穩(wěn)定和推廣優(yōu)良品種起著重要作用。在國際標準及國家標準中，均采用種子純度、凈度、發(fā)芽率和水分4個質(zhì)量特性來衡量種子質(zhì)量并以此定級。在這4項指標中，尤以品種純度為最重要。目前，我國玉米種子純度鑒定仍以形態(tài)鑒定、幼苗鑒定和田間小區(qū)種植鑒定為主，輔以同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)。然而，玉米品種數(shù)量越來越多，種質(zhì)基礎(chǔ)卻越來越狹窄，原有的檢測方法已不能滿足實際需要，實踐中迫切需要開發(fā)新的檢測技術(shù)。DNA指紋技術(shù)因其分辨率高、重復性好和簡單快速等優(yōu)點適應了這一需求。

2.2.3國家區(qū)試品種質(zhì)量監(jiān)控

DNA指紋技術(shù)在國家區(qū)試中主要應用于以下3個方面：

(1)供試組合的一致性檢測。如果供試組合本身不具有一致性，就失去作為一個品種的最基本條件，不能稱為一個品種，當然也就沒有進行區(qū)試的必要。實踐中，某些育種者為了盡快推出品種，可能用未完全純合的早代系組配組合，這樣的組合在若干性狀上尚未穩(wěn)定，不宜在生產(chǎn)中推廣。如果能在區(qū)試之前或早期就將這類組合剔除，將減少許多不必要的工作，使有限的資源集中到有希望的組合上。利用形態(tài)性狀檢測因周期長(至少一個生長季)無法起到預控的作用，只有DNA指紋技術(shù)才可能做到這一點。

(2)監(jiān)控組合在不同區(qū)試年份是否發(fā)生更換。實踐中，某些育種者對第一年區(qū)試表現(xiàn)不是十分突出的組合，在第二年區(qū)試時用另一個組合代替。在很多情況下，兩個組合具有一個共同親本或親緣關(guān)系較近，因此形態(tài)性狀上差別不太明顯，不易區(qū)別。如何防止這種情況發(fā)生，保證區(qū)試的公正性和嚴肅性，是區(qū)試工作中面臨的重要問題之一。DNA指紋技術(shù)的高鑒別能力適應了這一需要。