葉綠素含量測定方法優(yōu)劣和快速測定的步驟

　　葉綠素是光合作用最重要的產(chǎn)物，同時葉綠素含量也是植物重要的生理指標之一。因此，研究葉綠素的提取方法意義重大。葉綠素含量測定方法一般有分光光度法、活體葉綠素儀法和光聲光譜法，以分光光度法應用最廣泛。因所用提取葉綠素的溶劑不同又有多種測定方法，早期葉綠素測定廣泛采用葉綠素檢測儀，但該方法由于先研磨后除渣，工作量大、步驟多，且容易受光氧化而引起偏差，不適宜田間大量樣品的提取和測定。通過比較幾種不同混合提取液的提取，提出測定棉花葉片葉綠素含量的最佳方法為丙酮浸提法。分別對不同配比的丙酮、乙醇和水的混合液的浸提效果進行了研究，證明利用混合液進行葉綠素浸提的可行性。研究表明，丙酮與乙醇混合液提取葉綠素存在協(xié)同效應，且二者在等摩爾混合時提取效果最好，而研究認為，丙酮乙醇（2:1）混合液浸提葉綠素效果較好。該試驗在前人研究的基礎上進一步探討葉綠素含量測定各方法的優(yōu)劣及快速測定的步驟，為小白菜田間大樣本葉綠素含量測定提供依據(jù)。
　　1 材料與方法
　　1.1 試驗材料
　　將新鮮小白菜葉片洗凈、晾干、去大葉脈后剪碎混勻。試驗采用752S紫外可見分光光度計，丙酮、95%乙醇等試劑均為分析純，試驗用水為二次水。
　　1.2 試驗方法
　　1.2.1 不同浸提液提取效果試驗
　　稱取0.5 g試材于試管中，剪取葉片成2 mm碎條，在室溫下立即用丙酮研磨法和直接浸提法（4種提取液：95%乙醇，丙酮、乙醇（1:1），95%乙醇、丙酮、水（4.5:4.5:1），丙酮、95%乙醇（2:1））提取葉綠素，3次重復。浸提在黑暗中進行，每支試管加入浸提液10 mL,并不時搖動，等葉片變白，約14 h后定容25 mL,測定吸光值。室溫下以相應試劑為參比，分別在645 nm和663 nm處測定吸光度，由Arnon公式計算葉綠素a與葉綠素b的含量。葉綠素a（chla）含量（mg/g）=（12.7×A663-2.697×A645）7×V/（1000W）；葉綠素b（chb）含量（mg/g）=（22.77×A645-4.687×A663）7×V/（1000W）；葉綠素總含量（mg/g）=chla含量+chlb含量。式中A663、A645分別為相應波長下的吸光度值，V為提取液體積，W為所取葉片質量。
　　1.2.2 不同浸提液提取效果及穩(wěn)定性試驗
　　光穩(wěn)定性試驗：將樣品于測定后見光放置，分別于放置1、3、5 h后再次測定提取液中葉綠素的變化，比較葉綠素在不同提取液中的穩(wěn)定性。再使用葉面積測定儀測量小白菜葉的面積，熱穩(wěn)定性試驗：用浸提法進行葉綠素提取試驗，取提取液10 mL于有塞試管中，水浴中加熱，分別在30、50、70℃條件下保溫10 min,冷卻到室溫后，測定葉綠素含量。
　　2 結果與分析
　　2.1 不同提取方法的提取效果及光穩(wěn)定性比較
　　由表1~5可知，5種不同提取方法以混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法所得總葉綠素含量最高（為0.438）；乙醇浸提法最低（僅0.305）；其它3種提取方法相差不大。降解值以丙酮研磨法最快（為0.263）；混合液（乙醇B丙酮B水=4.5:4.5:1）浸提法其次（為0.208）；混合液（乙醇:丙酮=2:1）和混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法較慢（分別為0.185和0.165）。說明，丙酮研磨法可能因研磨過程破壞了葉綠體，所提取的葉綠素在光下極不穩(wěn)定。而混合液（乙醇:丙酮=2:1）和混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法可獲得較高的葉綠素含量，同時在光下也有較好的穩(wěn)定性。
　　隨見光時間的延長，各種提取方法均以葉綠素a降解值遠遠快于葉綠素b。不同提取方法葉綠素a降解值在0.133~0.288之間變化，而葉綠素b降解值0.020~0.053之間變化。另外，每種提取方法的chla/chlb值均隨見光時間的延長表現(xiàn)出逐漸減小的趨勢，也可反映出

　　表1 丙酮碾磨法所得葉綠素含量及光穩(wěn)定性比較

　　表2 乙醇浸提法所得葉綠素含量及光穩(wěn)定性比較

　　表3 乙醇:丙酮=1:1浸提法所得葉綠素含量及光穩(wěn)定性比較

　　表4 乙醇:丙酮=2:1浸提法所得葉綠素含量及光穩(wěn)定性比較

　　表5 乙醇:丙酮:水=4.5:4.5:1浸提法所得葉綠素含量及光穩(wěn)定性比較
　　葉綠素a降解速度快于葉綠素b。說明在可見光下，葉綠素a較葉綠素b更易降解。
　　2.2 不同浸提液提取方法的熱穩(wěn)定性比較
　　由表6可知，各浸提方法所得chla、chlb和Chla+b含量均隨溫度升高而降低，在70℃下，乙醇浸提法幾乎全變褐色，而其它處理仍可見到綠色，其中，以混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法Chla+b含量為最高。說明，單一乙醇浸提所得葉綠素含量較低且不穩(wěn)定，而加入丙酮后葉綠素含量提高且較穩(wěn)定。各處理chla/chlb值也隨溫度升高而減小，說明在高溫下葉綠素a較葉綠素b更易降解，與在光下的變化一致。

　　表6 不同提取方法的熱穩(wěn)定性比較
　　3 小結與討論
　　混合液浸提法不但所得葉綠素含量高于乙醇浸提法，且對光熱的穩(wěn)定性也優(yōu)于乙醇浸提法。其中以混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提所得葉綠素含量最高。試驗中單一乙醇浸提所得葉綠素含量較低，且不穩(wěn)定，當加入丙酮后葉綠素提取更完全，且穩(wěn)定性較好。結果表明，丙酮與乙醇混合液提取葉綠素存在協(xié)同效應，且二者在等摩爾混合時提取效果最好，這與研究結果一致。
　　試驗中丙酮研磨法也可得到較高的葉綠素含量，這與前人研究結果不同，具體原因有待于進一步研究。
　　但因研磨法所提取的葉綠素在光下極不穩(wěn)定，因而這種方法也不可取。綜合分析得出，小白菜葉綠素提取效果最好的是混合液（乙醇:丙酮=1:1）浸提法，其次為混合液（乙醇:丙酮:水=4.5:4.5:1）浸提法和混合液（乙醇:丙酮=2:1）浸提法，丙酮研磨法和乙醇浸提法效果最差。
　　隨見光時間的延長和溫度的增加，各種提取方法均以葉綠素a降解值遠遠快于葉綠素b。說明葉綠素a降解速度快于葉綠素b,這與的研究結果一致。結果表明，影響葉綠素提取效率的關鍵是葉綠素a的提取速度及其穩(wěn)定性保持。