反相高效液相色譜法：測定藏藥材中金絲桃苷含量

【摘要】 目的建立藏藥材紅毛五加藥材中金絲桃苷的含量測定方法并比較其不同藥用部位及不同產(chǎn)地、不同采收期的紅毛五加皮中金絲桃苷的含量。方法Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）,柱溫30℃，流動相甲醇（A）-0.5 %磷酸水溶液（B）,梯度洗脫，程序為：基線（A∶B=30∶70）,0～5 min（A∶B=35∶65）,5～15 min（A∶B=40∶60）,15～30 min（A∶B=50∶50）;檢測波長 358 nm,流速1 ml·min-1。結果金絲桃苷在2.90×10-3～0.58 μg范圍內(nèi)峰面積與進樣量具有良好的線性關系,回歸方程 Y =4×106X-14 065，r=0.999 9（n=9），平均回收率為100.6 %，RSD為0.96 %（n=6）。結論該法簡便、準確、重復性好,有助于紅毛五加質(zhì)量控制方法的研究。

【關鍵詞】 紅毛五加;金絲桃苷;反相高效液相色譜

Abstract：ObjectiveTo develop an RP-HPLC method for determination of Hyperoside in Acanthopanax giraldii Harms, ａnd to determine the contents of Hyperoside in different parts, different areas ａnd different collection time of Acanthopanax giraldii Harms. MethodsThe analysis was carried out at 30 ℃ on a Kromasil C18 column eluted with a mobile phase consisted of methanol（A）-0.5 %phosphoric acid（B）. The gradient elution was as following:ⅰ The ratio of A ａnd B was 35/65 from 0 to 5 min. ii The ratio of A ａnd B was 40/60 from 5 to 15 min.ⅲ The ratio of A ａnd B was 50/50 from 15 to 30 min.The detective wavelength was at 358 nm with the flow rate of 1.0 ml/min. ResultsThe calibration curve was linear within the concentration range of 2.90×10-3～0.58 μg with r of 0.999 9（n=9）.The average recovery was 100.6% ａnd RSD was 0.96% （n=6）.ConclusionThis method is simple, accurate ａnd reproducible. It is useful for quality control of Acanthopanax giraldii Harms.

Key words：Acanthopanax giraldii Harms ; Hyperoside ; RP-HPLC

藏藥材紅毛五加為五加科五加屬植物Acanthopanax giraldii Harms的干燥莖皮�！吨袊�藥典》尚未收載紅毛五加藥材。在文獻報道中發(fā)現(xiàn)刺五加中含有金絲桃苷成分[1]，金絲桃苷對鈣內(nèi)流有較強的選擇性阻滯作用，并對心肌有保護作用，對腦缺血損傷也有保護作用，調(diào)節(jié)免疫作用，臨床上主要用于治療心腦血管疾病、抗菌、抗炎、止咳、平喘、祛痰等，且療效突出，應用前景十分廣闊[2]，這與紅毛五加皮的對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[3]相一致。紅毛五加與刺五加為同科同屬植物，目前作者尚未查閱到紅毛五加中有關金絲桃苷的研究。四川為紅毛五加藥材的主要產(chǎn)區(qū)，其傳統(tǒng)的入藥部位為莖皮，本課題組的前期研究表明其莖皮中其它有效成分的含量較高[4～8]。本實驗擬采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法考察比較紅毛五加不同藥用部位、不同產(chǎn)地和不同采收期的紅毛五加皮中金絲桃苷的含量，以期為紅毛五加藥材的質(zhì)量控制、最佳采收期的確定、資源的合理利用提供參考。

1 儀器與材料

Waters2695高效液相色譜儀，Waters2996檢測器,Empower色譜工作站。金絲桃苷（批號111521-200303，中國藥品生物制品檢定所，含量測定用）;甲醇為色譜純;水為二次重蒸水;其余試劑均為分析純。9個不同產(chǎn)地的紅毛五加藥材樣品采自四川省境內(nèi)，經(jīng)劉圓教授鑒定為五加科五加屬植物Acanthopanax giraldii Harms的干燥莖皮。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Krosmasil C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），柱溫30℃。流動相為甲醇（A）-0.5 %磷酸水溶液（B）,梯度洗脫，程序為：基線（A∶B=30∶70）,0～5 min（A∶B=35∶65）,5～15 min（A∶B=40∶60）,15～30 min（A∶B=50∶50）;檢測波長358 nm,流速1 ml·min-1。金絲桃苷峰可以達到基線分離，峰形對稱，分離度好，按照金絲桃苷峰計，理論塔板數(shù)不應低于5 000，對照品溶液及紅毛五加樣品溶液的高效液相色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷對照品適量，加甲醇配置成29.00 μg·ml-1的溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備

稱取紅毛五加藥材粉末（過40目篩）約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中加入石油醚溶液25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，取出，過濾，棄去濾液，揮去溶劑，濾渣中加入25 ml甲醇，稱定重量，回流2 h，取出，冷卻至室溫，用甲醇補足減失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，過0.45 μm的微孔濾膜，作為樣品溶液。

2.3 線性關系的考察

分別精密量取上述對照品溶液0.1，0.5，1，2，4，6，10，20 μl，在上述色譜條件下測定峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為Y =4×106X-14 065，r=0.999 9（n=9）。結果表明金絲桃苷在2.90×10-3～0.58 μg范圍內(nèi)峰面積與進樣量具有良好的線性關系。

2.4 精密度實驗

精密吸取對照品溶液10 μl，重復進樣5次，測得峰面積的RSD為0.96 %（n=6）。結果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實驗

精密量取樣品溶液10 μl，分別于0，2，4，6，8 h測定。按照金絲桃苷對照品峰面積計算RSD為0.57%（n=6）。結果表明樣品溶液在配制后8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復性實驗

取紅毛五加皮樣品約2 g，精密稱取6份 ,按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定金絲桃苷的含量。結果樣品中金絲桃苷的量均值為99.68 μg/g，RSD為1.12%（n=6）,表明重復性良好。

2.7 加樣回收率實驗

精密稱取9份已知含金絲桃苷量的藥材粉末2.0 g，依次加入低、中、高3種質(zhì)量濃度金絲桃苷對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定。結果平均回收率為100.6%，RSD為0.96%（n=9）。

2.8 樣品測定

精密稱取紅毛五加的不同藥用部位及不同產(chǎn)地、不同采收期的紅毛五加皮（過40目篩）2 g。按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定。結果見表1～3，色譜圖見圖1。表1 紅毛五加不同部位金絲桃苷的含量（略）表2 不同產(chǎn)地紅毛五加皮中金絲桃苷的含量（略）表3 不同采收期紅毛五加皮中金絲桃苷的含量（略）

從實驗結果來看，紅毛五加各部位中葉中金絲桃苷的含量最高: 645.31 μg/g;四川阿壩茂縣的紅毛五加皮中金絲桃苷含量明顯高于其他產(chǎn)地，為179.42 μg/g;6月份的紅毛五加皮中金絲桃苷含量最高，為112.03 μg/g。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

以流動相作溶劑，在200～400 nm波長范圍內(nèi)測定了金絲桃苷對照品的紫外光譜圖，結果在256 nm 和358 nm波長處有最大吸收，確定358 nm為檢測波長。

3.2 提取方法的選擇

實驗中曾分別考察了用甲醇作為提取溶劑超聲0.5 h[9]，超聲1 h[10]，醋酸乙酯索氏提取[11]以及石油醚先脫脂，再加甲醇回流的提取方法[12]等4種方法測定同批試樣的含量，經(jīng)比較最后一種方法提取的最為完全，故采用石油醚先脫脂，再加甲醇回流的提取方法。

3.3 流動相的選擇

實驗曾考察了乙腈-0.05 %磷酸水溶液（16∶84）[13]、甲醇-0.1%磷酸溶液（40∶60）[10]、甲醇∶0.2 %磷酸溶液（45∶55）[14]為流動相，金絲桃苷的保留時間相對短些，但不能與其它化合物很好地分離。采用本文選擇的梯度洗脫，可以達到基線分離，峰形對稱，分離度好。

3.4 不同入藥部位藥效成分含量

從入藥部位來看，藏藥材紅毛五加的葉中金絲桃苷的含量最高，明顯高于紅毛五加皮中金絲桃苷的含量，與結合本課題組的前期研究成果相一致[15]，但是紅毛五加葉能否同等入藥，還需要進行更多化學成分分析和藥理實驗研究。

3.5 不同產(chǎn)地或采收期藥效成分含量

從不同產(chǎn)地來看，采自四川阿壩藏族羌族自治州茂縣的紅毛五加皮中金絲桃苷含量明顯高于其它產(chǎn)地。從不同采收期來看，6月份的紅毛五加皮中金絲桃苷含量最高。從實驗結果來看，紅毛五加藥材中金絲桃苷的含量除葉以外，其它含量值均低于0.05%，但仍為其質(zhì)量評價提供了一定的科學依據(jù)。