海帶葉綠素含量的測定方法

　　葉綠素是自然界生物光合作用的產(chǎn)物，它無毒可食用，所以廣泛應(yīng)用于食品、化裝品、藥物的著色，另外，在生化研究中也有非常重要的作用，故葉綠素的需要量很大，我國每年出口約1000t。目前葉綠素的生產(chǎn)，人們把精力主要集中在植物葉或以葉綠素含量較高的蠶沙上，但這要受到季節(jié)的影響，而且有些樹葉含有難以分離的毒素，且陸生植物葉子中葉綠素含量約為0.3%-0.5%。為了擴(kuò)大葉綠素的生產(chǎn)，發(fā)掘新的生產(chǎn)原料，我們把目光轉(zhuǎn)向了海洋。
　　眾所周知，海洋中的海藻和陸地植物一樣，也是通過光合作用來使光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能并維持自身生長的，由于水中可被利用的光能比陸地上少得多，要完成能量的轉(zhuǎn)換，必須增加參與光合作用的葉綠素的含量。所以，一般來說，海洋植物中葉綠素和其他輔助色素的含量高于陸生植物，而且海洋植物的生長快、產(chǎn)量大，故研究利用海洋植物來提取葉綠素對海洋資源的綜合開發(fā)、天然色素的提取，都具有非常重大和深遠(yuǎn)的意義。為此，我們選用海帶為原料，進(jìn)行葉綠素提取的研究。
　　1.材料和方法
　　1.1材料：浙江溫嶺海帶養(yǎng)殖場提供海帶干品
　　1.2儀器721型分光光度計(jì)、托普牌的葉綠素檢測儀、pH計(jì)、電熱恒溫水浴、電子稱、架盤天平、微型植物試樣粉碎機(jī)。
　　1.3試劑
　　石油醚、95%乙醇、95%丙酮、氫氧化鈉、硫酸銅、丙酮乙醇混合液（按體積比95:5配制）
　　1.4工藝流程
　　海帶→粉碎→加水洗凈→糊狀海帶→硫酸銅處理→洗滌干燥→浸提→提純→濃縮→皂化→干燥→產(chǎn)品
　　1.5測定方法
　　1.5.1吸光度值（OD）的測定：用721型分光光度計(jì)測定，根據(jù)吸光度值和變化情況加以分析，根據(jù)吸光度值來確定和選擇最優(yōu)條件。
　　1.5.2產(chǎn)品質(zhì)量分析：根據(jù)《食品添加劑手冊》P314-315測定。
　　1.5.3pH值：用酸度計(jì)測定。
　　1.5.4粗產(chǎn)品率：X%=W2/W1×100
　　W1-指海帶經(jīng)復(fù)水后機(jī)械脫水，并用濾紙吸干表面水分后的重量（g）
　　w2-指最終得到的葉綠素銅鈉粗品的重量（g）
　　2.結(jié)果與討論
　　2.1原料的預(yù)處理
　　2.1.1粉碎色素多含在細(xì)胞或填充在細(xì)胞腔的一些細(xì)胞組織中，粉碎在一定程度上破壞原料的細(xì)胞壁組織，除去色素向溶劑擴(kuò)散的主要障礙，從而加速溶劑滲人和色素溶解并擴(kuò)散的過程。
　　2.1.2冷水洗滌可除去泥沙和雜質(zhì)，且在洗滌過程中可把海帶表層附著的甘露醇沉下來。所以，洗滌液中可提取甘露醇。
　　2.1.3熱水浸泡冷水洗凈后的海帶還有一些溶于溫水的不利于色素提取的物質(zhì)，如海藻素等，用40-50℃溫水浸泡除去這些物質(zhì)。海帶與溫水比例為1:4,每次浸泡10-15而n,二次為宜。
　　2.1.4硫酸銅處理葉綠素分子中的噸被Cu取代，生成的綠色鹽更加穩(wěn)定，它耐光性強(qiáng)，不易被蛋白質(zhì)取代，還可減少葉黃素和類胡蘿卜素對浸提和提純的影響。色素分布于植物組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，銅鹽滲人其中需要一定時(shí)間，因此，不同的處理時(shí)間對色素提取有著不同的影響。實(shí)驗(yàn)用5%CuS儀溶液浸泡海帶進(jìn)行處理。
　　2.1.5洗滌，脫水硫酸銅處理結(jié)束后，先洗滌除去甘露醇銅沉淀物和硫酸銅。干海帶經(jīng)上述操作后吸附了大量的水，水的存在會(huì)影響浸提率和浸提速度，所以，先機(jī)械脫水，然后用濾紙吸附，以減少水對浸提的影響。
　　2.2浸提
　　2.2.1最大吸收峰γ的測定海帶處理13h后，加人丙酮乙醇混合液，料液比為1:50。在25℃的恒溫槽中浸提2h,過濾所得浸提液，并定容，用721分光光度計(jì)在380~680nm波長范圍內(nèi)掃描，取三次測定平均值作圖，見圖1。

圖1 波長與OD值關(guān)系圖
　　由圖1可知，在410nm和660nm二個(gè)波長下葉綠素銅鹽有二個(gè)最大吸收峰。綠色由紫色和紅色混合而成。410nm處于紫光區(qū)（400-435nm），由于在浸提過程沒有除雜，因此浸提液中雜質(zhì)的含量較高，如蛋白質(zhì)，葉黃素，類胡蘿卜素等，而這些雜質(zhì)的最大吸收峰接近410nm,因此實(shí)驗(yàn)中應(yīng)以僅660nm的OD值為準(zhǔn)。
　　2.2.2硫酸銅處理時(shí)間的確定

　　表1硫酸銅處理時(shí)間對浸提的影響
　　結(jié)果表明，硫酸銅處理時(shí)間以13h為好。
　　2.2.3浸提溶劑的選擇

　　表2不同溶劑對得率的影響
　　由表2可知，以95%的丙酮浸提效果最佳，但用丙酮浸提時(shí)，在濃縮成糊末產(chǎn)品時(shí)，有丙酮?dú)埩粼诋a(chǎn)品中，作為食品添加劑是不允許的。而用丙酮乙醇混合液浸提，其浸提率和丙酮浸提相差不大，同時(shí)濃縮回收時(shí)，殘留在產(chǎn)品中的乙醇對人體影響不大，所以選擇用丙酮乙醇混合液提取。
　　2.2.4浸提時(shí)間的選擇

　　表3浸提時(shí)間和得率的關(guān)系
　　可見浸提時(shí)間以2h為好。
　　2.2.5浸提溫度的確定

　　表4浸提溫度的影響
　　結(jié)果表明，60℃為宜，升高溫度能提高色素的浸出率，提高得率，但溫度過高影響色素的穩(wěn)定性。
　　綜上所述，提取的最佳條件是：原料用5%CuSO4處理13h,用50倍丙酮乙醇混合液于60℃浸提2h。
　　2.3濃縮、皂化、干燥將上述所得到的提取液裝人分液漏斗中，加入三分之一體積的石油醚震蕩2而n,靜置分層，下層水相是葉綠素銅鹽液，上層油相是葉黃素、葉酸等雜質(zhì)。取下層液，用5%Na0H調(diào)節(jié)pH=11,裝人燒瓶，接通冷凝器，在水浴鍋上加熱回流lh進(jìn)行皂化，然后回收丙酮，濃縮產(chǎn)品，隨著丙酮量的減少，可適當(dāng)提高溫度回收丙酮，一般溫度不超過70℃，至不能回收丙酮時(shí)為止。把濃縮液移人烤盤中，放人印℃恒溫干燥箱中干燥，得到墨綠色塊狀產(chǎn)品，碾磨成粉末，即得葉綠素銅鈉鹽粗品，避光保存。測得平均得率為5.03%。
　　3.產(chǎn)品性能試驗(yàn)
　　3.1產(chǎn)品為墨綠色粉末，易吸潮，易溶于水，水溶液綠色透明，略溶于乙醇和丙酮，有鈣離子存在時(shí)，則有沉淀析出。
　　3.2取試樣作焰色試驗(yàn)，當(dāng)試樣溶液的濃度較高時(shí)，可明顯觀察到火焰開始呈綠色，后呈黃色。
　　3.3pH值用蒸餾水配制成1%溶液，其pH值為9.70。
　　3.4吸收峰取試樣0.1g配成100ml水溶液，在380nm-660nm波長范圍內(nèi)掃描，此溶液最大吸收峰為405和630nm,消光值之比E405/E630=0.686/0.178=3.85,符合標(biāo)準(zhǔn)要求。