油菜籽硫甙的測定－光度法

1．范圍

本標準規(guī)定了采用光度法測定油菜籽中硫甙含量的方法。

本標準適用于油菜常規(guī)育種、雜交三系、兩系育種、輻射育種以及生物技術選育中芥酸硫甙含量檢測以及油菜種子和商品油菜籽收購過程中硫甙含量快速測定。

2．原理

利用酶的專一性，油菜籽中硫甙與特異性酶（Gln MEN）反應后，生成產(chǎn)物與專用顯色劑（Chrom G）反應形成有特征吸收峰的有色產(chǎn)物，根據(jù)標準曲線測定硫甙含量。

3．試劑

除特殊標明外，所有試劑均為分析純（A.R）,水為GB/T6682規(guī)定的二級水。

3.1 硫甙測定A液。

3.2 硫甙測定B液。

3.3 硫甙測試板。

4．儀器設備

實驗室常規(guī)儀器及下列各項。

4.1 微型粉碎機。

4.2 電子天平（量程 0-200 g，最小讀數(shù)100 mg）。

4.3 40-200 μL微量移液器。

4.4 1000 μL微量移液器。

4.5 脫脂棉。

4.6 石英比色杯（18 mm×18 mm）。

4.7 芥酸硫甙速測儀。

5．取樣

按照GB5491扦取油菜籽樣品，取樣時，應清除樣品外來雜質(zhì)。

6．操作步驟

6.1 試樣的制備

按照GB5491對扦取的油菜籽樣品進行縮分，取其中一份樣品約10 g在微型粉碎機中粉碎20秒，將粉碎物混勻，再粉碎5秒（亦可用研缽將樣品研碎過40目篩）。

6.2 稱樣

準確稱取0.50 g（精確到100 mg）樣品于5 mL具塞試管中。

6.3 提取

用移液管加入3 mL硫甙測定A液，蓋緊蓋子，用力搖動試管，混勻后反應8分鐘(中途再混勻兩次)。

6.4 過濾

用玻璃棒將蓬松、紋路一致、適量的脫脂棉緩緩塞入試管中，當脫脂棉接觸液面后，將試管平放桌面上，讓脫脂棉自動吸液，吸滿后，豎起離心管再用玻璃棒將脫脂棉往下輕壓，至濾出清液為止，也可采用離心或濾紙過濾得到上清液。

6.5 酶－顯色反應

取出密封保存的硫甙測試板（可分條取用，其它密封，避光保存），用微量移液器取50 μL 上清液于測試板孔中，同時選一孔加入50 μL硫甙測定B液作為空白；酶解反應8min，中途用吸耳機吹氣兩次，使酶解反應均勻一致。

6.6 顯色液稀釋

用微量移液器取150 μL硫甙測定B液，分別加入空白孔及樣品孔中，繼續(xù)反應2min，中途吹氣一次，使體系均勻穩(wěn)定。

6.7 測定

在芥酸硫甙速測儀上，以試劑空白作零點，選擇“儀器校準”，記憶零點值，然后選擇“樣品測量”，即可進行樣品測試分析，讀數(shù)值即為每克油菜餅粕中所含硫甙總量的微摩爾數(shù)（μmol／g）。

7．精密度和允許誤差

重復測定相對標準偏差小于6％；兩次平行測定結(jié)果芥酸相差小于0.8%；兩次平行測定結(jié)果硫甙相差小于4.0μmol/g。測定結(jié)果用算術平均值表示。