蛋白濃度測定及常用方法

蛋白質(zhì)溶液濃度測定方法有多種，下述幾種方法可供選用。蛋白質(zhì)濃度的測定，往往用于計算純化方法的回收率的重要方法。

一、蛋白濃度的直接測定（UV法）

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

二、比色法蛋白濃度測定蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。

一、雙縮脲法雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法，至今仍廣泛采用。在需要快速，但不很準確的測定中，常用此法。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍色絡(luò)合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如Tris、Good緩沖液等。可用沉淀法除去干擾物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，然后棄去上清液，再用已知體積的1m NaOH溶解沉淀的蛋白質(zhì)進行定量測定。

三、BCA（Bicinchoninine acid assay）法

這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極強，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑干擾。

四、Lowry法

此法是雙縮脲法的進一步發(fā)展。他的第一步就是雙縮脲反應(yīng)，即Cu++與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物，然后這個絡(luò)合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑），結(jié)果得到深藍色物。此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測定20mg/L～400mg/L含量的蛋白質(zhì)溶液。其干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，要注意的是，加入福林試劑時要特別小心，試劑只在酸性pH環(huán)境中才穩(wěn)定，上述提到的還原反應(yīng)只有在pH10時才發(fā)生，因此，福林試劑加入到堿性的Cu2+-蛋白質(zhì)溶液中時，必須立刻攪拌，以使磷鉬酸-磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2+-蛋白質(zhì)絡(luò)合物所還原。

試劑：1.試劑 A： 2% Na2CO3/0.1 N NaOH.(Na2CO310g, NaOH 2g 用蒸餾水稀釋至５００毫升)。
2.試劑Ｂ：Ba ： 1% CuSO4˙5H2OBb : 2% 酒石酸鉀鈉(分別配制并存放于棕色瓶內(nèi)，用時勿搖起沉淀。)
3．試劑C：將 Ba 0.1ml 與 Bb 0.1ml 混勻后，再加A 10ml 4.Folin – Ciocalten 試劑:用前與水1:1稀釋。５．ＢＳＡ：蛋白標準液�。保韌/ml:10mg 結(jié)晶小牛血清蛋白加于5ml蒸餾水的10ml 容量瓶表面,待溶,勿劇搖起泡,用蒸餾水小心沖洗至刻度10ml