電泳分析常用方法

（一）醋酸纖維素薄膜電泳
醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯。由該物質(zhì)制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附性小，幾乎能完全消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象，又因?yàn)槟さ挠H水性比較小，它所容納的緩沖液也少，電泳時(shí)電流的大部分由樣品傳導(dǎo)，所以分離速度快，電泳時(shí)間短，樣品用量少，5μg 的蛋白質(zhì)可得到滿意的分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測(cè)。
醋酸纖維素膜經(jīng)過(guò)冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化有利于對(duì)電泳圖譜的光吸收掃描測(cè)定和膜的長(zhǎng)期保存。
⒈材料與試劑 醋酸纖維素膜一般使用市售商品，常用的電泳緩沖液為pH8.6 的巴比妥緩沖液，濃度在0.05-0.09mol/L。
⒉操作要點(diǎn)
⑴膜的預(yù)處理：必須于電泳前將膜片浸泡于緩沖液，浸透后，取出膜片并用濾紙吸去多余的緩沖液，不可吸得過(guò)干。
⑵加樣：樣品用量依樣品濃度、本身性質(zhì)、染色方法及檢測(cè)方法等因素決定。對(duì)血清蛋白質(zhì)的常規(guī)電泳分析，每 cm加樣線不超過(guò)1μl，相當(dāng)于60-80μg的蛋白質(zhì)。
⑶電泳：可在室溫下進(jìn)行。電壓為25V/cm，電流為0.4-0.6mA/cm寬。
⑷染色：一般蛋白質(zhì)染色常使用氨基黑和麗春紅，糖蛋白用甲苯胺藍(lán)或過(guò)碘酸-Schiff 試劑，脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。
⑸脫色與透明：對(duì)水溶性染料最普遍應(yīng)用的脫色劑是5％醋酸水溶液。為了長(zhǎng)期保存或進(jìn)行光吸收掃描測(cè)定，可浸入冰醋酸：無(wú)水乙醇＝30:70（V/V）的透明液中。

（二）凝膠電泳
以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法 稱為凝膠電泳。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠
孔徑較大，對(duì)一般蛋白質(zhì)不起分子篩作用，但適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應(yīng)用較廣，介紹如下：
⒈瓊脂糖凝膠電泳的原理概述 瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤(pán)繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。在臨床生化檢驗(yàn)中常用于LDH、CK等同工酶的檢測(cè)。
⒉瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的基本技術(shù) 在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，DNA 分子的電泳遷移率與其分子量的常用對(duì)數(shù)成反比；分子構(gòu)型也對(duì)遷移率有影響，如共價(jià)閉環(huán) DNA＞直線DNA＞開(kāi)環(huán)雙鏈DNA。當(dāng)凝膠濃度太高時(shí)，凝膠孔徑變小，環(huán)狀DNA（球形）不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0，而同等大小的直線DNA
（剛性棒狀）可以按長(zhǎng)軸方向前移，相對(duì)遷移率大于 0。
⑴設(shè)備與試劑：瓊脂糖凝膠電泳分為垂直及水平型兩種。其中水平型可制備低濃度瓊脂糖凝膠，而且制膠與加樣都比較方便，故應(yīng)用比較廣泛。核酸分離一般用連續(xù)緩沖體系，常用的有 TBE（0.08mol/L Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA）和THE（0.04mol/L Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸鈉，0.0018mol/L EDTA）。
⑵凝膠制備：用上述緩沖液配制0.5％-0.8％瓊脂糖凝膠溶液，沸水浴或微波爐加熱使之融化，冷至55℃時(shí)加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5μg/ml，然后將其注入玻璃板或有機(jī)玻璃板組裝好的模子中，厚度依樣品濃度而定。注膠時(shí)，梳齒下端距玻璃板 0.5-1.0mm，待脫凝固后，取出梳子，加入適量電極緩沖液使板膠浸沒(méi)在緩沖液下 1mm處。
⑶樣品制備與加樣：溶解于TBE或THE內(nèi)的樣品應(yīng)含指示染料（0.025％溴酚藍(lán)或桔黃橙）、蔗糖（10％-15％）或甘油（5％-10％），也可使用2.5％FicoⅡ增加比重，使樣品集中，每齒孔可加樣 5-10μg。
⑷電泳：一般電壓為5-15V/cm。對(duì)大分子的分離可用電壓5V/cm。電泳過(guò)程最好在低溫條件下進(jìn)行。
⑸樣品回收：電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察樣品的分離情況，對(duì)需要的DNA分子或特殊片段可從電泳后的凝膠中以不同的方法進(jìn)行回收，如電泳洗脫法：在紫外燈下切取含核酸區(qū)帶的凝膠，將其裝入透析袋（內(nèi)含適量新鮮電泳緩沖液），扎緊透析袋后，平放在水平型電泳槽兩電極之間的淺層緩沖液中，100V電泳2-3小時(shí)，然后正負(fù)電極交換，反向電泳2分鐘，使透析袋上的DNA釋放出來(lái)。吸出含 DNA的溶液，進(jìn)行酚抽提、乙醇沉淀等步驟即可完成樣品的回收。
其它還有低融點(diǎn)瓊脂糖法、醋酸銨溶液浸出法、冷凍擠壓法等，但各種方法都僅僅有利于小分子量 DNA片段（＜1kb）的回收，隨著DNA分子量的增大，回收量顯著下降。
（三）等電聚焦電泳技術(shù)
等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問(wèn)世的一種利用有pH 梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可達(dá)0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分。
⒈IEF的基本原理 在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽(yáng)極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽(yáng)極移動(dòng)，直至某一 pH位點(diǎn)時(shí)失去電荷而停止移動(dòng)，此處介質(zhì)的 pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)（pl）。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動(dòng)，直到它們的等電點(diǎn)上聚焦為止�？梢�(jiàn)在該方法中，等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有 pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的 pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。
⒉pH梯度的組成 pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由于其不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負(fù)極間引入等電點(diǎn)彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負(fù)極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開(kāi)始前兩性電解質(zhì)的混合物pH為一均值，即各段介質(zhì)中的pH相等，用pH0表示。電泳開(kāi)始后，混合物中pH最低的分子，帶負(fù)電荷最多，pI1為其等電點(diǎn)，向正極移動(dòng)速度最快，當(dāng)移動(dòng)到正極附近的酸液界面時(shí)，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，這一分子不再向前移動(dòng)而停留在此區(qū)域內(nèi)。由于兩性電解質(zhì)具有一定的緩沖能力，使其周?chē)�一定的區(qū)域內(nèi)介質(zhì)的pH保持在它的等電點(diǎn)范圍。pH稍高的第二種兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pI2，也移向正極，由于pI2＞pI1，因此定位于第一種兩性電解質(zhì)之后，這樣，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)按各自的等電點(diǎn)依次排列，形成了從正極到負(fù)極等電點(diǎn)遞增，由低到高的線性pH梯度，如圖 16-3所示。
⒊兩性電解質(zhì)載體與支持介質(zhì) 理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過(guò)。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個(gè)體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開(kāi)，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。
常用的pH梯度支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠為最常應(yīng)用。
電泳后，不可用染色劑直接染色，因?yàn)槌Ｓ玫牡鞍踪|(zhì)染色劑也能和兩性電解質(zhì)結(jié)合，因此應(yīng)先將凝膠浸泡在5％的三氯醋酸中去除兩性電解質(zhì)，然后再以適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ旧��?BR>（四）其他電泳技術(shù)
⒈IEF/SDS-PAGE雙向電泳法 1975年O′Farrall等人根據(jù)不同組份之間的等電點(diǎn)差異和分子量差異建立了 IEF/SD S-PAGE雙向電泳。其中IEF電泳（管柱狀）為第一向，SDS-PAGE 為第二向（平板）。在進(jìn)行第一向IEF電泳時(shí)，電泳體系中應(yīng)加入高濃度尿素、適量非離子型去污劑NP-40。蛋白質(zhì)樣品中除含有這兩種物質(zhì)外還應(yīng)有二硫蘇糖醇以促使蛋白質(zhì)變性和肽鏈?zhǔn)嬲�。IEF電泳結(jié)束后，將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應(yīng)用的樣品處理液（內(nèi)含SDS、β-巰基乙醇）中振蕩平衡，然后包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端，即可進(jìn)行第二向電泳。
IEF/ SDS-PAGE雙向電泳對(duì)蛋白質(zhì)（包括核糖體蛋白、組蛋白等）的分離是極為精細(xì)的，因此特別適合于分離細(xì)菌或細(xì)胞中復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分。
⒉毛細(xì)管電泳 Neuhoff等人于1973年建立了毛細(xì)管均一濃度和梯度濃度凝膠用來(lái)分析微量蛋白質(zhì)的方法，即微柱膠電泳，均一濃度的凝膠是將毛細(xì)管浸入凝膠混合液中，使凝膠充滿總體積的2/3左右，然后將其撳入約厚2mm的代用粘土墊上，封閉管底，用一支直徑比盛凝膠的毛細(xì)管更細(xì)的硬質(zhì)玻璃毛細(xì)管吸水鋪在凝膠上。聚合后，除去水層并用毛細(xì)管加蛋白質(zhì)溶液（0.1-1.0μl，濃度為1-3mg/ml）于凝膠上，毛細(xì)管的空隙用電極緩沖液注滿，切除插入粘土部分，即可電泳。
目前毛細(xì)管電泳分析儀的誕生，特別是美國(guó)生物系統(tǒng)公司的高效電泳色譜儀為 DNA片段、蛋白質(zhì)及多肽等生物大分子的分離、回收提供了快速、有效的途徑。高效電泳色譜法是將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術(shù)溶為一體，在從凝膠中洗脫樣品時(shí)，連續(xù)的洗脫液流載著分離好的成分，通過(guò)一個(gè)連機(jī)檢測(cè)器，將結(jié)果顯示并打印記錄。高效電泳色譜法既具有凝膠電泳固有的高分辨率，生物相容性的優(yōu)點(diǎn)，又可方便地連續(xù)洗脫樣品。

各電泳法，除另有規(guī)定外，照下述方法操作。
一、紙電泳法
1.儀器裝置 包括電泳室及直流電源兩部分。 常用的水平式電泳室裝置如圖，包括兩個(gè)電泳槽 A和一個(gè)可以密封的玻璃(或相應(yīng)材料)蓋B；兩側(cè)的電泳槽均用有機(jī)玻璃（或相應(yīng)材料）板 C分成兩部分；外格裝有鉑電極(直徑0.5～0.8cm)D；里格為可放濾紙 E的有機(jī)玻璃電泳槽架F，此架可從槽中取出；兩側(cè)電泳槽A內(nèi)的鉑電極 D經(jīng)隔離導(dǎo)線穿過(guò)槽壁與外接電泳儀電源相連。 電源為具有穩(wěn)壓器的直流電源，常壓電泳一般在 100～500V，高壓電泳一般在500～10 000V。
2. 操作法
(1) 電泳緩沖液
枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0) 取枸櫞酸 (C6H8O7·H2O)39.04g 與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g，加水 4000ml，使溶解。
(2) 濾紙
取色譜濾紙置 1mol/L甲酸溶液中浸泡過(guò)夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH 值不低于4,置60℃烘箱烘干，備用。可按需要裁成長(zhǎng)27cm、寬18cm的濾紙，或根據(jù)電泳室的大小裁剪，并在距長(zhǎng)度方向一端 5～8cm處劃一起始線，每隔2.5～3cm 處做一記號(hào)備點(diǎn)樣用。
(3) 點(diǎn)樣 有濕點(diǎn)法和干點(diǎn)法。
濕點(diǎn)法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)中，濕潤(rùn)后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，置電泳槽架上，使起始線靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩沖液中，然后用微量注射器精密點(diǎn)加供試品溶液，每點(diǎn) 10μl,共3點(diǎn)，并留 2個(gè)空白位置。
干點(diǎn)法是將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上，吹干、再點(diǎn)，反復(fù)數(shù)次，直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧器將濾紙噴濕，點(diǎn)樣處最后噴濕，本法適用于稀的供試品溶液。
(4) 電泳
于電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒(méi)鉑電極，接通電泳儀穩(wěn)壓電源擋,調(diào)整電壓梯度為 18～20V/cm，電泳約1小時(shí)45分鐘，取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點(diǎn)的位置。
(5) 含量測(cè)定
剪下供試品斑點(diǎn)和與斑點(diǎn)位置面積相近的空白濾紙，剪成細(xì)條，分別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置1小時(shí)，用3號(hào)垂熔玻璃漏斗濾過(guò)，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定測(cè)定吸收度，并按吸收系數(shù)計(jì)算含量。
二、醋酸纖維素薄膜電泳法
1.儀器裝置
電泳室及直流電源同紙電泳。
2.試劑
(1) 巴比妥緩沖液(pH8.6)
取巴比妥 2.76g，巴比妥鈉15.45g，加水溶解使成1000ml。
(2) 氨基黑染色液
取 0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
(3) 漂洗液
取乙醇 45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混勻。
(4) 透明液
取冰醋酸 25ml，加無(wú)水乙醇75ml，混勻。
3.操作法
(1) 醋酸纖維素薄膜
取醋酸纖維素薄膜，裁成 2cm×8cm的膜條，將無(wú)光澤面向下，浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夾于濾紙中，輕輕吸去多余的緩沖液后,將膜條無(wú)光澤面向上,置電泳槽架上,經(jīng)濾紙橋浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中。
(2) 點(diǎn)樣與電泳
于膜條上距負(fù)極端 2cm處，條狀滴加蛋白含量約5％的供試品溶液2～3μl,在 10～12V/cm電位梯度下電泳。電泳區(qū)帶距離以4～5cm為宜。
(3) 染色
電泳完畢，將膜條取下浸于氨基黑染色液中，2～3 分鐘后，用漂洗液浸洗數(shù)次，直至脫去底色為止。
(4) 透明
將洗凈并完全干后的膜條浸于透明液中 10～15分鐘，取出平鋪于潔凈的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度計(jì)上測(cè)定和作標(biāo)本長(zhǎng)期保存。
(5) 含量測(cè)定
未經(jīng)透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法測(cè)定，一般采用洗脫法或掃描法，測(cè)定各蛋白質(zhì)組分的相對(duì)百分含量。 洗脫法 將洗凈的膜條用濾紙吸干，剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區(qū)帶，分別浸于1.6％的氫氧化鈉溶液中，振搖數(shù)次，至洗脫完全， 于一定波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度。同時(shí)剪取與供試品膜條相應(yīng)的無(wú)蛋白部位，同法操作作對(duì)照。先計(jì)算吸收值總和，再計(jì)算各蛋白組分所占百分率。 掃描法 將干燥的醋酸纖維素薄膜用色譜掃描儀通過(guò)反射 （未透明薄膜） 或透射（已透明薄膜）方式在記錄器上自動(dòng)繪出各蛋白組分曲線圖，橫坐標(biāo)為膜條的長(zhǎng)度，縱坐標(biāo)為吸收度，計(jì)算各蛋白組分的百分含量。
亦可用微機(jī)處理積分計(jì)算。

三、瓊脂糖凝膠電泳法
1.儀器裝置
電泳室及直流電源同紙電泳。
2.試劑
(1) 醋酸－鋰鹽緩沖液(pH3.0)
取冰醋酸 50ml，加水800ml混合后，用氫氧化鋰調(diào)節(jié)pH至3.0，再加水至
1000ml。
(2) 甲苯胺藍(lán)溶液
取甲苯胺藍(lán) 0.1g，加水100ml使溶解。
3.操作法
(1)制膠
取瓊脂糖約 0.2g，加水10ml，置水浴中加熱使溶脹完全,加溫?zé)岬拇姿幔�鋰鹽緩沖液(pH3.0)10ml，混勻，趁熱將膠液涂布于大小適宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上，厚度約 3mm，靜置，待凝膠結(jié)成無(wú)氣泡的均勻薄層，即得。 (2) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液的制備照各藥品項(xiàng)下規(guī)定配制。
(3) 點(diǎn)樣與電泳
在電泳槽內(nèi)加入醋酸－鋰鹽緩沖液(pH3.0),將凝膠板置于電泳槽架上，經(jīng)濾紙橋浸入緩沖液。于凝膠板負(fù)極端分別點(diǎn)樣 1μl，立即接通電源，在電壓梯度約 30V/cm，電流強(qiáng)度1～2mA/cm的條件下，電泳約20分鐘，關(guān)閉電源。
(4) 染色與脫色
取下凝膠板，用甲苯胺藍(lán)溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景無(wú)色為止。
四、聚丙烯酰胺凝膠電泳法
1.儀器裝置
通常由穩(wěn)流電泳儀和圓盤(pán)或平板電泳槽組成。其電泳室有上、下兩槽,每個(gè)槽中都有固定的鉑電極，鉑電極經(jīng)隔離電線接于電泳儀穩(wěn)流擋上。
2.試劑
(1)溶液 A
取三羥甲基氨基甲烷 36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L鹽酸溶液48ml，再加水溶解并稀釋至 100ml,置棕色瓶?jī)?nèi)，在冰箱中保存。
(2)溶液 B
取丙烯酰胺 30.0g、次甲基雙丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀釋至100ml,濾過(guò)，置棕色瓶?jī)?nèi)，在冰箱中保存。
(3)電極緩沖液(pH8.3)
取三羥甲基氨基甲烷 6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀釋至1000ml，置冰箱中保存，用前稀釋 10倍。
(4)溴酚藍(lán)指示液
取溴酚藍(lán) 0.1g,加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0ml與90％乙醇5ml,微熱使溶解，加 20％乙醇制成250ml。
(5)染色液
取 0.25％(W/V)考馬斯亮藍(lán)G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至 10ml。
(6)稀染色液
取上述染色液 2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(7)脫色液
(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液的制備
照各藥品項(xiàng)下的規(guī)定。
(3)電泳
將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤(pán)電泳槽內(nèi)，每管加供試品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液50～100μl，為防止擴(kuò)散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚藍(lán)指示液 1滴,也可直接在上槽緩沖液中加0.04％溴酚藍(lán)指示液數(shù)滴，玻璃管的上部用電極緩沖液充滿，上端接負(fù)極、下端接正極。調(diào)節(jié)起始電流使每管為1mA，數(shù)分鐘后，加大電流使每管為 2～3mA，當(dāng)溴酚藍(lán)指示液移至距玻璃管底部1cm處，關(guān)閉電源。
(4)染色和脫色
電泳完畢，用裝有長(zhǎng)針頭并吸滿水的注射器,自膠管底部沿膠管壁將水壓入，膠條即從管內(nèi)滑出，將膠條浸入稀染色液過(guò)夜或用染色液浸泡 10～30分鐘，以水漂洗干凈，再用脫色液脫色至無(wú)蛋白區(qū)帶凝膠的底色透明為止。
(5)結(jié)果判斷將膠條置燈下觀察，根據(jù)供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的色帶位置和色澤深淺程度進(jìn)行判斷。
相對(duì)遷移率 供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的電泳區(qū)帶有時(shí)可用相對(duì)遷移率(R＇＇<[m]>)進(jìn)行比
較。其計(jì)算式如下： 進(jìn)膠端到供試品或標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)帶的距離 相對(duì)遷移率(R＇＇<[m]>)＝──進(jìn)膠端到溴酚藍(lán)區(qū)帶的距離 掃描 將清晰的膠條置雙波長(zhǎng)薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描并積分，由各組分的峰面積計(jì)算百分含量。7％醋酸溶液。
3.操作法
(1)制膠
取溶液 A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混勻，抽氣趕去溶液中氣泡， 加 0.56％過(guò)硫酸銨溶液2ml，混勻制成膠液，立即用裝有長(zhǎng)針頭的注射器或細(xì)滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使膠層高度達(dá) 6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆蓋膠面，管底氣泡必須趕走，靜置約 30分鐘，待出現(xiàn)明顯界面時(shí)即聚合完畢，吸去水層。
五、SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法
SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白分子量,是根據(jù)大多數(shù)蛋白都能與陽(yáng)離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結(jié)合成復(fù)合物,使蛋白分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)天然蛋白分子的負(fù)電荷，消除了不同蛋白分子的電荷效應(yīng),使蛋白分子相對(duì)遷移率(R＇＇<[m]>)的大小完全取決于分子量的高低，因此可從已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的對(duì)數(shù)和相對(duì)遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出供試品的分子量。
1.儀器裝置
除另有規(guī)定外，同聚丙烯酰胺凝膠電泳。
2.試劑
(1)丙烯酰胺液溶
稱取丙烯酰胺 22.2g與雙丙烯酰胺0.6g， 溶于100ml水中，貯于褐色瓶中低溫保存。
(2) 凝膠緩沖液
稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)8.82g 、 磷酸氫二 鈉(Na2HPO4 ·12H2O)51.55g與十二烷基硫酸鈉2.0g，加水至1000ml(若有沉淀析出,可加溫至 37℃溶解)。
(3)電泳緩沖液
將凝膠緩沖液稀釋 1倍。
(4)染色液
稱取 25mg考馬斯亮藍(lán)R<[250]>,溶于57％乙醇與9.2％醋酸混合液100ml中。
(5)脫色液
取無(wú)水乙醇 75ml，加冰醋酸50ml，用水稀釋至1000ml。
3.操作法
除下列規(guī)定外，其他均同聚丙烯酰胺凝膠電泳。
(1)制膠
用丙烯酰胺溶液－凝膠緩沖液－水－1.6％過(guò)硫酸銨溶液-四甲基乙二胺(需冷卻)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045) 配制而成。
(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液及供試品溶液的制備
取標(biāo)準(zhǔn)蛋白，加水制成每1ml中含2～5mg的溶液，與水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸鈉 0.04g，溶于40ml水中)1∶3混合，置冰箱中過(guò)夜。供試品照上述方法配制。
(3)電泳 調(diào)節(jié)電流使每管為 8mA。
4.相對(duì)遷移率和分子量計(jì)算
將電泳脫色后的區(qū)帶用卡尺或用掃描定位法測(cè)量染料移動(dòng)的距離、染色前膠條長(zhǎng)度、蛋白移動(dòng)距離和脫色后的膠條長(zhǎng)度。按下式計(jì)算相對(duì)遷移率： 蛋白移動(dòng)的距離 染色前的膠條長(zhǎng)度 相對(duì)遷移率(R＇＇<[m]>)＝───×─── 脫色后的膠條長(zhǎng)度 染料移動(dòng)的前沿距離 以 R＇＇<[m]>為橫坐標(biāo),已知分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪圖,由標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出供試品分子量。